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為指導各級醫(yī)療機構和其他檢測機構規(guī)范開展百日咳實驗室檢測工作，準確識別百日咳確診病例，確保檢測質量，提高檢測效率，制定本指南。

一、樣本采集

（一）采樣人員要求。從事標本采集的技術人員應經過生物安全培訓，熟練掌握標本采集方法和操作流程。

（二）樣本采集。樣本種類主要有鼻咽拭子、鼻咽吸取液、血清等?？ㄋ诨虔d咳期早期患者建議采集鼻咽拭子，持續(xù)咳嗽2—3周或以上的患者建議開展血清學檢測。

二、實驗室檢測

（一）百日咳鮑特菌培養(yǎng)。

1.菌株分離培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)優(yōu)先采集鼻咽拭子，其次為鼻咽吸取液。采集鼻咽拭子后，可直接接種培養(yǎng)基，也可經增菌培養(yǎng)后接種，增菌可提高培養(yǎng)陽性率。培養(yǎng)基一般為含選擇性添加劑的鮑-金培養(yǎng)基（B—G培養(yǎng)基）或木炭瓊脂培養(yǎng)基（R—L培養(yǎng)基）平板。如不能立即接種，需將鼻咽拭子放入轉運管中，4℃冷藏運送至實驗室，分區(qū)劃線接種后35℃—37℃培養(yǎng)，每日檢查有無疑似菌落，連續(xù)觀察3—7天，若無任何細菌生長痕跡，第7天可報告百日咳鮑特菌陰性。若有疑似菌落生長，及時挑取疑似菌落，在不含選擇性添加劑的B—G培養(yǎng)基或R—L培養(yǎng)基平板上進行純菌分離培養(yǎng)。

2.結果判定。培養(yǎng)到百日咳鮑特菌，結合臨床表現(xiàn)可診斷為百日咳確診病例?？赏ㄟ^觀察菌落形態(tài)、革蘭染色鏡檢、生化反應等進行菌落種屬鑒定，也可采取特定靶基因核酸檢測、基因組測序或質譜檢測等方式進行種屬鑒定。

（二）百日咳鮑特菌核酸檢測。

1.提取DNA。核酸檢測優(yōu)先采集鼻咽拭子，其次為鼻咽吸取液，也可使用培養(yǎng)接種后的拭子進行核酸檢測。為提高核酸檢測陽性率，建議單獨采樣。將拭子在無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中洗脫，離心去除上清液，沉渣提取DNA，用于核酸檢測；如不能立即提取，可—70℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2.結果判定。國內常用實時熒光PCR技術檢測百日咳鮑特菌。核酸檢測結果陽性，結合臨床表現(xiàn)可診斷為百日咳確診病例。陰性結果應進一步排除假陰性，假陰性的可能原因包括：樣本質量差；樣本采集時間過早或過晚；樣本保存、運輸和處理不當；其他原因如PCR抑制等。

（三）血清學檢測。

1.適用范圍。百日咳鮑特菌血清學檢測不適用于嬰幼兒、1年內接種含百日咳成分疫苗和既往感染的個體。

2.檢測方法和質控。常用的血清學檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），以雙份血清或單份血清的PT—IgG抗體為檢測指標。檢測試劑盒結果PT—IgG抗體濃度數(shù)據(jù)可溯源至國際標準單位。每次檢測需同時檢測試劑盒提供的陰性和陽性質控品。

3.結果判定。對于百日咳疑似病例或臨床診斷病例，具有以下任一項者，可明確診斷：單份血清百日咳鮑特菌PT—IgG抗體濃度超過診斷急性感染的標準閾值（試劑盒推薦閾值）；恢復期血清PT—IgG抗體滴（濃）度較急性期呈4倍及以上升高。

（四）全基因組測序。

全基因組測序參照國家致病菌識別網《細菌純培養(yǎng)物二代基因組測序操作規(guī)范》《細菌純培養(yǎng)物二代加三代基因組測序操作規(guī)范》執(zhí)行。

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百日咳實驗室檢測技術指南